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    人(Human)线粒体呼吸链复合物Ⅳ(complex Ⅳ)

    发布时间: 2020-02-18  点击次数: 226次

    检测原理

    试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被线粒体呼吸链复合物Ⅳcomplex Ⅳ)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的线粒体呼吸链复合物Ⅳcomplex Ⅳ)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品活性。

    样品收集、处理及保存方法

    1.  血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

    2.  血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

    3.  细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

    4.  组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

    5.  保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

    自备物品

    1. 酶标仪(450nm)
    2. 高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
    3. 37℃恒温箱

    操作注意事项

    •   试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
    •  
    •  实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
    •   浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍,最终结果乘以5才是样本实际浓度。
    •   严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
    •   所有液体组分使用前充分摇匀。
    • 试剂盒组成

      名称

      96孔配置

      48孔配置

      备注

      微孔酶标板

      12孔×8条

      12孔×4条

      标准品

      0.3mL*6管

      0.3mL*6管

      样本稀释液

      6mL

      3mL

      检测抗体-HRP

      10mL

      5mL

      20×洗涤缓冲液

      25mL

      15mL

      按说明书进行稀释

      底物A

      6mL

      3mL

      底物B

      6mL

      3mL

      终止液

      6mL

      3mL

      封板膜

      2张

      2张

      说明书

      1份

      1份

      自封袋

      1个

      1个

      注:标准品(S0-S5)浓度依次为:0、36122448 U/mL

      试剂的准备

       20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

      洗板方法

    •   手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。
    •   自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
    • 操作步骤

    •   从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
    •   设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
    •   样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。
    •   除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗